Ocena toksykologiczna Germanu

„Uprzejmie informuję, że część treści na tej stronie została wygenerowana przy użyciu automatycznego tłumacza. Przepraszam za ewentualne błędy językowe lub stylistyczne. Jeśli styl pisowni jest dla kogoś problematyczny, zachęcam do zamknięcia strony. Serdecznie pozdrawiam!”

Artykuł naukowy – tłumaczenie.
Ocena toksykologiczna półtoratlenku germanu
( Organiczny German ) opracowany przez:

Hindawi
Journal of Toxicology
Volume 2020, Article ID 6275625, 17 pages
https://doi.org/10.1155/2020/6275625

Robin A. Reddeman ,1 R´obert Gl´avits,2 John R. Endres ,1 Timothy S. Murbach ,1
G´abor Hirka,2 Ad´el V´ertesi,2 Erzs´ebet B´eres,2 and Ilona Pasics Szakonyin´e2
1AIBMR Life Sciences, Inc., 2800 E. Madison St., Suite 202, Seattle, WA 98373, USA
2Toxi-Coop Zrt., H-1122 Budapest, Magyar Jakobinusok Tere 4/B, Hungary
Correspondence should be addressed to Timothy S. Murbach; tim@aibmr.com
Received 12 July 2019; Revised 15 November 2019; Accepted 22 November 2019; Published 4 April 2020
Academic Editor: Cinta Porte

Prawa autorskie © 2020 Robin A. Reddeman et al. (Artykuł jest udostępniany na zasadach licencji Creative Commons Attribution, która pozwala na nieograniczone korzystanie, dystrybucję i reprodukcję w dowolnym medium, pod warunkiem prawidłowego cytowania oryginalnej pracy. 

Przeprowadzono serię toksykologicznych badań zgodnych z zaleceniami OECD i GLP w celu oceny bezpieczeństwa wysoce oczyszczonego seskwitlenku germanu, organicznego związku pierwiastka śladowego germanu, który występuje naturalnie i nie jest niezbędny dla organizmu. Udowodniono, że dwutlenek germanu i cytrynian mleczanu germanu (nieorganiczne związki germanu) wywołują toksyczność nerkową, podczas gdy seskwitlenek germanu (organicznego germanu) ma bardziej korzystny profil bezpieczeństwa. Jednak wcześniejsze badania toksyczności związków seskwitlenku germanu nie precyzowały jednoznacznie czystości badanych związków. W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono dowodów na mutagenność w teście odwrotnej mutacji bakterii ani w teście aberracji chromosomalnych u ssaków in vitro. Nie zaobserwowano również aktywności genotoksycznej w teście mikronukleusów u ssaków in vivo przy stężeniach do dawki granicznej 2000 mg/kg mc./dobę. W 90-dniowym badaniu toksyczności doustnej powtarzanej dawki przeprowadzonym na szczurach Han:WIST w dawkach 0, 500, 1000 i 2000 mg/kg mc./dobę przez podanie zgłowowe nie stwierdzono zgonów, niepożądanych efektów związanych z leczeniem ani narządów docelowych. Określono, że nieobserwowane dawki wywołujące działanie niepożądane (NOAEL) wynosiły 2000 mg/kg mc./dobę.

1. Wprowadzenie: Organiczny german jest naturalnie występującym śladowym pierwiastkiem, który znajduje się w glebie, skałach, wodzie słodkiej, roślinach (np. żeń-szeń, aloes i czosnek) oraz w większości żywności, choć w śladowych ilościach [1]. W latach 70. i 80. XX wieku stosowanie związków zawierających german jako suplementów diety i leków w celu poprawy zdrowia stało się popularne w Japonii, Wielkiej Brytanii i innych krajach. Jednak wkrótce pojawiły się doniesienia o toksycznych skutkach po chronicznym spożyciu preparatów zawierających german [1–7]. Dodatkowo, błędy dotyczące raportowania, które konkretne związki germanu zostały spożywane, spowodowały dużą dezinformację dotyczącą ogólnego bezpieczeństwa germanu [2]. Późniejsze badania toksykologiczne nad związkami zawierającymi german wykazały znaczące różnice w profilach toksyczności między dwutlenkiem germanu (nieorganiczny german) a germanem seskutlenkowym (Ge-132, organiczny german) [1, 2, 8]. Podczas gdy dwutlenek germanu wywołał toksyczność nerkową w modelach zwierzęcych [9, 10] i został zidentyfikowany jako jeden z toksycznych czynników w doniesieniach o toksyczności nerkowej u ludzi (podobnie jak cytrynian laktan germanu) [1, 3–7, 11], Ge-132 wykazał bardziej korzystny profil bezpieczeństwa [8, 12, 13]. Niemniej jednak, dane toksykologiczne i kliniczne dotyczące Ge-132, które zostały opublikowane, są ograniczone. Opublikowano badanie toksyczności doustnej powtarzanej dawki Ge-132 (1000 mg/kg masy ciała (mc), 5 dni w tygodniu, około 714 mg/kg mc/dzień) u szczurów w 1992 roku, które wskazywało na pewne niekorzystne działania na nerki [13]. Jednak czystość badanego produktu nie została podana, a użyto tylko jednej grupy dawkowania. W badaniu doustnym trwającym 24 tygodnie z 16-tygodniowym okresem rekonwalescencji, porównującym wpływ dwutlenku germanu (75 mg/kg mc/dzień) do Ge-132 (120 mg/kg mc/dzień), stwierdzono, że dwutlenek germanu wywoływał istotne toksyczność ogólnoustrojową i nerkową, która utrzymywała się przez 16 tygodni po zaprzestaniu leczenia [8].

   U zwierząt poddanych podawaniu Ge-132 stwierdzono wahania poziomu azotu mocznikowego we krwi, jednak nie zaobserwowano toksyczności ogólnoustrojowej ani nieprawidłowości nerkowych. W innym 6-miesięcznym badaniu toksyczności doustnej Ge-132 nie stwierdzono żadnych toksycznych efektów ani nieprawidłowości przy dawkach 30, 300 i 3000 mg/kg mc/dzień, ale nie podano czystości testowanego preparatu ani szczegółów dotyczących metod i wyników badania [12]. W 26-tygodniowym badaniu karcynogenności dodanie Ge-132 (czystość ≥99%) do diety myszy w stężeniach 0,3%, 0,8% i 2,5% nie wywoływało wzrostu neoplazmów związanych z leczeniem w porównaniu z grupą kontrolną [14].

   Brak jednoznacznych danych utrudnia wykluczenie możliwości skutków po chronicznym spożyciu lub spożyciu w dużych dawkach Ge-132. Dalsze badania dotyczące profilu bezpieczeństwa Ge-132 są szczególnie interesujące ze względu na jego potencjalne zastosowanie jako składnik żywności lub suplementu diety w celu wspierania zdrowia człowieka lub uzyskania korzyści terapeutycznych [13, 15]. W związku z tym, przedstawiamy tutaj in vitro i in vivo ocenę toksykologiczną wysoko czystego Ge-132.

   2. Materiały i metody: Wszystkie główne badania przeprowadzono zgodnie z zasadami Dobrych Praktyk Laboratoryjnych (GLP) Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), ENV/MC/CHEM (98)17 [16]. Metody badań są opisane wcześniej przez Clewell et al. [17], Marx et al. [18] i Reddemana et al. [19], a sekcja metodyczna częściowo reprodukuje nasze sformułowanie. Wszystkie użyte substancje chemiczne, rozpuszczalniki, leki i inne chemikalia były klasyfikowane jako czystość analityczna lub farmaceutyczna.

   2.1. Przedmiot badania Przedmiotem badania było Ge-132 (biz(2-karboksyetylo)seskutlenek germanu, numer CAS: 12758-40-6, masa cząsteczkowa 339,42, wzór chemiczny C6H10Ge2O7), organiczna forma naturalnie występującego śladowego pierwiastka germanu. Badany związek został wyprodukowany i dostarczony przez sponsora, firmę Designed Nutritional Products (Orem, Utah). Synteza Ge-132 kontynuowana była poprzez przekształcenie ditlenku germanu (GeO2) za pomocą dostosowania pH, filtracji, płukania i suszenia w celu uzyskania białego krystalicznego proszku o czystości ≥99,6%, który zawiera między 42,5-43,1% pierwiastka germanu i <50 ppm zanieczyszczenia GeO2. Aby zapewnić produkcję produktu o wysokiej czystości, po rozpuszczeniu GeO2 zastosowano środki mechaniczne do usunięcia śladowych ilości nierozpuszczonego GeO2, a następnie dodano nadmiar kwasu akrylowego w stosunku stechiometrycznym, aby zapewnić ukończenie nieodwracalnej reakcji. Czystość i zanieczyszczenie GeO2 zostały potwierdzone dla każdej partii Ge-132, a granica wykrywalności GeO2 wynosiła około 0,5 ppm. Do analizy czystości i zanieczyszczeń zastosowano chromatografię cieczową wysokosprawnościową połączoną z indukcyjnie sprzężonym plazmowym spektrometrem masowym na podstawie niezależnie zweryfikowanych modyfikacji metod Krystek et al. [21, 22]. Pozytywna identyfikacja i odpowiednia czystość chemiczna badanego przedmiotu (partia 4845 dla testów genotoksyczności i 4895 dla badania 90-dniowego) zostały potwierdzone przez laboratorium na podstawie certyfikatu analitycznego dostarczonego przez sponsora.

2. 2. Metody testowe: Badania in vitro

   2.2.1. Test mutagenności bakteryjnej odwrotnej mutacji. Badanie przeprowadzono zgodnie z procedurami ustalonymi przez Amesa et al. [23], Marona i Amesa [24], Kiera et al. [25] oraz Venitta i Parry’ego [26], a także zgodnie z następującymi wytycznymi: wytyczne testowe OECD 471 [27] i SOP laboratorium. Do badania użyto szczepów Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 i TA1537 oraz szczepu Escherichia coli WP2 uvrA (Moltox, Inc.) w obecności i braku systemu aktywacji metabolicznej (mieszanina S9 – frakcja wątroby szczura od Moltox, Inc., USA). Based on the preliminary solubility and concentration range finding test results, the main (plate incorporation procedure) and confirmatory (preincubation procedure) tests were conducted using ultrapure water (ASTM Typ I) jako nośnik dla substancji testowej stosowano azotan sodu (SAZ, Merck KGaA, Niemcy, Darmstadt), a jako nośnik dla 4-nitro-1,2-fenylenodiaminy (NPD, Merck KGaA, Niemcy, Darmstadt), 9-aminoakrydyny (9AA, Merck KGaA) oraz 2-aminoantracenu (2AA, Sigma-Aldrich, Niemcy, USA) stosowano dimetylosulfotlenek (DMSO, Merck KGaA, Niemcy, Darmstadt). Stężenia substancji testowej wynosiły 5000, 1600, 500, 160, 50 i 16 μg/otokę. Ze względu na rozpuszczalność substancji testowej, stosowano objętość podania wynoszącą 0,25 ml. Większa niż zwykle objętość podania nie wpływała istotnie na rozcieńczenie żelu agarowego ani na jego skład; równoczesne badanie kontrolne nośników potwierdziło akceptowalność większej objętości podania. Kontrole pozytywne i negatywne były wybierane zgodnie z wytycznymi i literaturą. Czułość, wiarygodność i potencjał aktywacyjny promutagenu systemu aktywacji metabolicznej były potwierdzane przez dostawcę za pomocą znanych kontroli i dalszych badań z zastosowaniem roztworów kontrolnych. Roztwór testowy był przygotowywany świeżo na początku każdego eksperymentu (delikatnie podgrzewano w celu ułatwienia rozpuszczania substancji testowej). Liczbę kolonii obliczano ręcznie, a na jej podstawie obliczano średnie wartości, odchylenia standardowe i wskaźniki mutacji. Zgodnie z wytycznymi testowymi i ustalonymi kryteriami laboratorium, substancja testowa była uważana za mutagenną, jeśli wystąpiło co najmniej jedno z poniższych: (i) Stwierdzono zależny od stężenia wzrost liczby kolonii revertantów i/lub (ii) Stwierdzono powtarzalną biologicznie istotną dodatnią odpowiedź co najmniej dla jednej grupy dawkowej w co najmniej jednym szczepie, z lub bez aktywacji metabolicznej. Wzrost liczby revertantów uważano za biologicznie istotny, jeśli wystąpiło co najmniej jedno z poniższych: (i) Liczba revertantów w szczepach S. typhimurium TA98 i/lub TA100 i/lub E. coli WP2 uvrA była co najmniej dwukrotnie wyższa niż liczba revertantów w kontrolach nośnikowych (wskaź także oznaczony odwróceniem ≥ 2) i/lub; (ii) Liczba revertantów w szczepach S. typhimurium TA1535 i/lub TA1537 była co najmniej trzykrotnie wyższa niż liczba revertantów w kontrolach nośnikowych (wskaźnik odwrócenia ≥ 3).

   Substancja testowa była uważana za nie-mutagenną, jeśli nie stwierdzono kryteriów mutagennej odpowiedzi. Ponieważ kryterium biologicznej istotności było stosowane do interpretacji wyników, nie przeprowadzano oceny statystycznej.

   2.2.2. Test aberracji chromosomowych in vitro w komórkach ssaków. Test został przeprowadzony zgodnie z międzynarodowo akceptowaną wytyczną OCED 473 [28] na hodowanych komórkach płuc chińskiego chomika V79 (European Collection of Cell Cultures).

   Na podstawie wyników wstępnych testów rozpuszczalności i cytotoksyczności wybrano zmodyfikowany roztwór podstawowy Dulbecco (DME, Sigma-Aldrich, Niemcy, USA) jako nośnik do przygotowania roztworów substancji testowych, a stężenia substancji testowej wybrano do głównego testu. Kontrola pozytywna bez aktywacji metabolicznej to metanuł metanesulfonian (EMS, Sigma-Aldrich Co., Niemcy, USA) rozpuszczony w DME w końcowych stężeniach 0,4 lub 1,0 μL/mL, ponieważ jest to znany mutagen i klastogen, a testowe laboratorium posiada szeroką bazę danych dotyczącą jego stosowania. Kontrola pozytywna z aktywacją metaboliczną to jednowodny monohydrat cyklofosfamidu (Sigma-Aldrich, Niemcy, USA) rozpuszczony w DME w celu uzyskania końcowego stężenia 5,0 μg/mL.

   W eksperymencie A, podwójne hodowle V79 (5 × 105 komórek/grupa) były narażane na odpowiednią kontrolę nośnikową, kontrolę pozytywną i każde stężenie substancji testowej (500 μg/mL, 1000 μg/mL, 2000 μg/mL) z i bez aktywacji metabolicznej przez okres 3 godzin. Po okresie ekspozycji komórki były płukane DME, a pobranie próbek odbywało się 20 godzin od rozpoczęcia leczenia.

   Eksperyment B został przeprowadzony tak samo jak eksperyment A, z wyjątkiem tego, że okres ekspozycji bez aktywacji metabolicznej wynosił 20 godzin, a pobieranie próbek odbywało się 20 i 28 godzin po rozpoczęciu leczenia. Okres ekspozycji z aktyw acją metaboliczną pozostał 3 godziny, ale pobranie próbek odbyło się 28 godzin po rozpoczęciu leczenia.

   Zgodnie z wytycznymi testowymi, hodowle komórek były traktowane kolchicyną (0,2 μL/mL, Sigma-Aldrich Co., Niemcy, USA) 2,5 godziny przed pobraniem próbek, a następnie przygotowywano i oceniano zestawy slajdów w sposób ślepy. Nomenklatura i klasyfikacja aberracji chromosomowych opierały się na ISCN i Savage [29–31]. W celu analizy statystycznej przeprowadzono test chi-kwadrat i analizę regresji.

   2.3. Badania na zwierzętach. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Toxi-Coop Zrt. zezwolił na przeprowadzenie tych badań na zwierzętach, które były przeprowadzane zgodnie z Krajową Wytyczną Rady Naukowej dotyczącą Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych oraz zgodnie z zasadami węgierskiego ustawy CLVIII z 2011 r. (zmodyfikowanej węgierskiej ustawy XXVIII z 1998 r.) i Rozporządzenia Rządu 40/2013 regulującego ochronę zwierząt.

   2.3.1. Test na micronukleusy u myszy in vivo. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami OECD 474 [32]. Do przeprowadzenia tego badania wykorzystano myszy specjalnej linii CRL:NMRI BR, wolne od konkretnych patogenów, w wieku ośmiu tygodni i o masach ciała od 34,3 do 37,9 g. Aklimatyzacja i opieka nad zwierzętami przeprowadzono zgodnie z wytycznymi testowymi.

   Jako kontrolę pojazdową i rozpuszczalnik dla substancji testowej stosowano wodny metylcelulozoz (1%, Molar Chemicals Kft., Węgry). Do kontroli pozytywnej użyto cyklofosfamidu rozpuszczonego w wodzie destylowanej (Naturland Kft, Węgry). Formulacje substancji testowej były przygotowywane świeżo każdego dnia podawania w stężeniach 50 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL i były używane w ciągu dwóch godzin.

   Na podstawie wyników testu toksyczności wstępnej przeprowadzonej zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP), do głównego badania wybrano dawki 500 mg/kg/mc, 1000 mg/kg/mc i 2000 mg/kg/mc, podawane doustnie w dwóch dawkach oddzielonych o 24 godziny. Samce myszy CRL:NMRI BR zostały losowo podzielone na pięć grup: kontrola pojazdowa, kontrola pozytywna i trzy grupy testowe. Kontrola pozytywna, cyklofosfamid w dawce 60 mg/kg/mc, została podana jednorazowo dootrzewnowo. Myszy były obserwowane pod kątem widocznych oznak reakcji na podanie substancji od razu po podaniu oraz w regularnych odstępach czasu do momentu usmiercenia (za pomocą odwłoku). W grupach z substancją testową i kontrolą rozpuszczalnikową pobierano próbki raz, 24 godziny po drugim podaniu. W grupie z kontrolą pozytywną pobierano próbki 24 godziny po rozpoczęciu podawania. Szpik kostny pobierano z dwóch wystawionych kości udowych myszy z każdego punktu czasowego tuż po usmierceniu, a rozmazy przygotowywano na standardowych szkiełkach mikroskopowych i oceniano zgodnie z zaleceniami testowymi pod kątem występowania komórek z micronukleusami i odsetka niedojrzałych erytrocytów w stosunku do ogółu (niedojrzałe + dojrzałe) erytrocytów. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu testu Kruskalla-Wallisa, nieparametrycznego jednoczynnikowego analizy wariancji (ANOVA), oraz analizy regresji.

2.3.2. Badania toksyczności doustnej powtarzanej przez 90 dni u szczurów. Badanie przeprowadzono zgodnie z procedurami opisanymi w wytycznych OECD 408 (jako minimalny standard) [33]. Szczury SPF Han:WIST (Toxi-coop, Zrt, Budapeszt, Węgry) w wieku 52-66 dni, ważące od 212 do 261 g (samce) i od 143 do 168 g (samice), zostały poddane aklimatyzacji i utrzymane w warunkach środowiskowych zgodnie z wytycznymi OECD 408. Zwierzęta otrzymywały pokarm (ssniff®SM R/M-Z +H, pełnoporcjowe pożywienie dla szczurów i myszy, produkowane przez ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Niemcy) oraz wodę pitną ad libitum, z wyjątkiem nocnej deprywacji pokarmowej przed pobraniem krwi. Wybór dawek oparto na danych z nieopublikowanego badania toksyczności doustnej powtarzanej przez 14 dni zgodnie z wytycznymi OECD 407 u szczurów Han:WIST, w którym nie zaobserwowano żadnych zgonów ani toksycznych efektów w żadnym z badanych parametrów, a ustalono dawkę oznaczoną jako NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect Level) wynoszącą 2000 mg/kg mc/dzień. W związku z tym, substancja testowa do badania trwającego 90 dni była przygotowana w 1% wodnym roztworze metylcelulozy w stężeniach 50, 100 i 200 mg/mL do podawania doustnego w ilości 0 (tylko pojazd), 500, 1000 i 2000 mg/kg mc/dzień (10 zwierząt na grupę płci) w objętości dawki 10 mL/kg mc. W odstępstwie od GLP, zamiast kontroli analitycznej, każda formuła była przygotowywana codziennie tuż przed podaniem i używana w ciągu czterech godzin od przygotowania. Zgodnie z wytycznymi, codzienne i tygodniowe obserwacje kliniczne były przeprowadzane, a w ostatnim tygodniu ekspozycji, z użyciem zmodyfikowanego testu Irwina [34], przeprowadzono test obserwacji funkcjonalnej (Functional Observation Battery – FOB). Mierzono indywidualną masę ciała i obliczano przyrost masy ciała. Określano zużycie pokarmu i obliczano wydajność pokarmy. Przeprowadzono również badanie okulistyczne na wszystkich szczurach podczas okresu aklimatyzacji oraz na wszystkich zwierzętach z grupy kontrolnej i wysokodawkowej przed zakończeniem testu.

Wszystkie zwierzęta zostały zważone przed usmierceniem w celu obliczenia względnej masy narządów. Przeprowadzono pełne badania histologiczne zachowanych narządów i tkanek zwierząt z grupy kontrolnej i wysokodawkowej oraz na podstawie makroskopowych wyników u zwierząt z grup niskodawkowej i średniodawkowej. Samce i samice szczurów były oceniane osobno, a przeprowadzono analizy statystyczne. Test homogeniczności wariancji Bartletta został użyty do oceny heterogeniczności wariancji między grupami; jeśli nie wykryto istotnej heterogeniczności, przeprowadzano analizę wariancji (ANOVA). W przypadku pozytywnego wyniku używano testu zakresu wielokrotnego Duncana do oceny istotności różnic międzygrupowych. Gdzie stwierdzono istotną heterogeniczność, normalny rozkład danych był badany za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. W przypadku rozkładu nieliniowego, stosowano nieparametryczną metodę analizy wariancji Kruskala-Wallisa. Jeśli wynik był pozytywny, porównania międzygrupowe przeprowadzano za pomocą testu U-Manna-Whitneya. Istotność statystyczną przyjmowano, gdy wartość p była mniejsza niż 0,05. Częstości objawów klinicznych, ophthalmoskopii, wyniki patologiczne i histopatologiczne według płci i dawki zostały obliczone, ale nie poddawano analizie statystycznej.

3. Wyniki i dyskusja: 3.1. Test odwróconej mutacji bakteryjnej. W teście potwierdzającym liczba kolonii revertant dla E. coli WP2 uvrA przy stężeniu 5000 μg/płytka z aktywacją metaboliczną przekraczała zakres historycznych danych kontrolnych dla pojazdu. To zwiększenie nie było zależne od dawki, a wskaźnik mutacji (1,67) był znacznie poniżej progu genotoksycznego dla pozytywnego testu. Nie stwierdzono żadnego tła hamowania ani stężeniowo zależnego ani biologicznie istotnego wzrostu liczby kolonii revertant w żadnym z pięciu szczepów testowych, w żadnym poziomie stężenia, zarówno w obecności, jak i w nieobecności aktywacji metabolicznej w początkowych lub potwierdzających testach mutacji (patrz tabele 1 i 2). Wszystkie kryteria ważności i akceptowalności testów zostały spełnione, a wszystkie wyniki były jednoznacznie negatywne. 

Wyniki liczby aberracji w kontrolach pojazdu mieściły się w zakresie danych historycznych dla kontroli. Jednoczesne kontrole pozytywne spowodowały oczekiwane, istotne biologicznie zwiększenie liczby komórek z strukturalnymi aberracjami chromosomalnymi w porównaniu z kontrolami pojazdu, a wzrost był porównywalny do danych historycznych.

W warunkach eksperymentów A i B, Ge-132 nie wywoływał statystycznie istotnego wzrostu liczby komórek z aberracjami bez przerw w żadnym badanym stężeniu w porównaniu z kontrolami pojazdu i historycznymi kontrolami. Nie stwierdzono również żadnych poliploidowych lub endoreduplikujących się metafaz. Nie było istotnych statystycznie różnic między grupą testową a kontrolą pojazdu, ani nie zaobserwowano zależności dawki-wyjściu (patrz tabela 3). Wszystkie kryteria ważności i akceptowalności przeprowadzonych testów zostały spełnione, a wszystkie wyniki były jednoznacznie negatywne.

Po zakończeniu leczenia, pobierano próbki krwi do badań patologii klinicznej (hematologia i chemia kliniczna) z siatkówki żyłowej zaopatrzonej w retroorbitalny splot żylny pod narkozą izofluranową CP® (Medicus Partner, Kft., Węgry). Przeprowadzono badania patologiczne brutto na każdym zwierzęciu po usmierceniu przez odwirowanie z aorty brzusznej po potwierdzeniu znieczulenia.

3.3. Test Micronukleusów In Vivo na Myszy. Wstępne badanie toksyczności nie wykazało żadnej śmiertelności ani efektów specyficznych dla płci. W głównym badaniu nie zaobserwowano żadnych zgonów ani niepożądanych reakcji na leczenie u myszy w grupach kontrolnej, pozytywnej i żadnej z grup testowych. Myszy traktowane cyklofosfamidem wykazywały oczekiwane duże, statystycznie istotne wzrosty liczby mikronukleowanych erytrocytów polichromatycznych (MPCE) w porównaniu z grupami kontrolną pojazdu i historyczną, co potwierdzało odpowiednią czułość testu. Nie stwierdzono biologicznie ani statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania MPCE w żadnej z grup testowych 24 godziny po drugim podaniu w porównaniu z grupami kontrolną pojazdu i historyczną. Odsetek PCE wśród ogólnej populacji erytrocytów w próbce pobranej po 24 godzinach w grupach o dawkach 500 i 1000 mg/kg mc. był podobny do grupy kontrolnej pojazdu. Odsetek PCE wśród ogólnej populacji erytrocytów był nieznacznie, ale nieistotnie statystycznie ani biologicznie zmniejszony w grupie o dawce 2000 mg/kg mc. w porównaniu z grupą kontrolną pojazdu, co dowodzi ekspozycji szpiku kostnego na substancję testową (patrz tabela 4). Wszystkie kryteria ważności i akceptowalności przeprowadzonych testów zostały spełnione, a wszystkie wyniki były jednoznacznie negatywne.

3.4. 90-dniowe badanie toksyczności doustnej o powtarzanych dawkach u szczurów. Nie zaobserwowano żadnych zgonów w żadnej z grup przez okres 90/91 dni badania (odpowiednio samce/samice). W codziennych obserwacjach klinicznych zaobserwowano u samców i samic zwierząt w grupach o dawkach 1000 i 2000 mg/kg mc odchody bladawe w porównaniu do normy.

Grupy o dawkach 1000 i 2000 mg/kg mc. wykazywały miękkie niż normalne stolce u samców i samic, a grupa o dawce 2000 mg/kg mc. miała także odchody bardziej miękkie niż normalne. Chociaż było to prawdopodobnie związane z substancją testową lub jej metabolitami, być może wynikiem efektu osmotycznego spowodowanego zwiększoną dawką substancji testowej, zmiany w stolcu nie były uważane za biologicznie lub toksykologicznie istotne ze względu na brak korelujących zmian klinicznych lub patologicznych. Przejściowo obserwowano zmniejszoną aktywność u jednego samca z grupy o dawce 2000 mg/kg mc. między dniem 51 a 54. Łysienie zaobserwowano na przednich kończynach jednego samca i na brzuchu jednej samicy w grupie kontrolnej oraz na przednich kończynach jednego samca z grupy o dawce 500 mg/kg mc. od dnia 85 do końca badania. Łysienie i zmniejszona aktywność nie były uważane za związane z substancją testową ze względu na ich przejściowy i izolowany charakter oraz większe występowanie u zwierząt kontrolnych. W szczegółowych cotygodniowych badaniach klinicznych zachowanie i stan fizyczny wszystkich traktowanych zwierząt było normalne przez cały okres badania (z wyjątkiem opisanego wcześniej łysienia). Nie zaobserwowano różnic w zachowaniu ani reakcji na bodźce w grupach leczonych w porównaniu z grupą kontrolną podczas badania FOB. Nie stwierdzono zmian w badaniu okulistycznym w grupach o dawce 2000 mg/kg mc. grupy kontrolnej.

W przypadku samców szczurów nie stwierdzono istotnych statystycznie zmian w masie ciała w stosunku do grupy kontrolnej w grupach o niskiej i średniej dawce (patrz Tabela 5), ale przyrost masy ciała był istotnie zakłócony we wszystkich grupach leczonych w różnych okresach obserwacji (patrz Tabela 6). Istotny statystycznie spadek średniego przyrostu masy ciała u samców o wysokiej dawce spowodował niższą średnią masę ciała ogólną. Jednak istotne różnice w średnich masach ciała w porównaniu z grupą kontrolną wynosiły <10% i dlatego uznano je za bez znaczenia toksykologicznego. Pozostałe istotne statystycznie wzrosty i spadki przyrostu masy ciała u samców o niskiej i średniej dawce były sporadyczne i nie miały wpływu na ogólny przyrost masy ciała lub średnie masy ciała. U samic nie stwierdzono istotnych statystycznie zmian w masie ciała w stosunku do grupy kontrolnej (patrz Dodatkowa Tabela 1). Samice w grupie o wysokiej dawce wykazywały istotne statystycznie zmiany w przyroście masy ciała, z wzrostami obserwowanymi między dniem 77 a 84 oraz spadkami między dniem 84 a 89 (patrz Dodatkowa Tabela 2); jednak łączny przyrost masy ciała był podobny do grupy kontrolnej. Zmiany w przyroście masy ciała u samic były niewielkie i sporadyczne i nie miały wpływu na ogólny rozwój masy ciała. Dlatego te zmiany (u samców i samic) nie były uważane za istotne toksykologicznie.

Średnie dzienne spożycie pokarmu było podobne do grupy kontrolnej we wszystkich grupach dawkowych przez całe badanie (patrz Dodatkowa Tabela 3). Przejściowe i łączne statystycznie istotne zmiany zaobserwowano w nieznacznie zwiększonych wartościach efektywności wykorzystania pokarmu u samców o dawce 1000 i 2000 mg/kg mc. (patrz Tabela 7). Te zmiany oznaczają nieznacznie niższą efektywność wykorzystania pokarmu u samców o średniej i wysokiej dawce, prawdopodobnie związane z niższym przyrostem masy ciała opisanym powyżej. Z wyjątkiem izolowanej poprawy efektywności wykorzystania pokarmu dla grup o niskiej i wysokiej dawce (tylko w 3. tygodniu), efektywność wykorzystania pokarmu u samic nie była zakłócona. W związku z tym te zmiany nie były uważane za istotne toksykologicznie (patrz Dodatkowa Tabela 4).

W grupach leczonych zaobserwowano kilka istotnych statystycznie zmian w parametrach hematologicznych między płciami (patrz Tabela 8, Dodatkowa Tabela 5). W grupach leczonych zaobserwowano również wiele istotnych statystycznie zmian w parametrach biochemii klinicznej (patrz Tabela 9). Te zmiany nie były uważane za związane z testowanym związkiem, ponieważ wiele z nich były sporadyczne i mieściły się w zakresach historycznych, a niektóre były prawdopodobnie wynikiem wartości kontrolnych znajdujących się poza zakresem normy. Ponadto, nie zaobserwowano związanych z nimi zmian histopatologicznych. Dlatego też, te zmiany uważano za mające niewielkie lub żadne znaczenie biologiczne.

Podczas makroskopowego badania stwierdzono sporadyczne zmiany w narządach kontrolnych i/lub grup leczonych obu płci, o podobnej częstości występowania i/lub bez zależności od dawki. związek (patrz Tabela 10).

Obserwowane zmiany makroskopowe zostały uznane za przypadkowe, typowe dla tego szczepu i wieku szczurów, lub wystąpiły w związku z procesem wykrwawiania (płuca, grasica i wątroba) i nie były uważane za związane z testowanym związkiem.

W przypadku samców szczurów, w grupach leczonych średnimi i wysokimi dawkami zaobserwowano kilka statystycznie istotnych różnic wagi narządów (względnej i bezwzględnej w stosunku do masy ciała) w porównaniu do grup kontrolnych (patrz Tabela 11, Dodatkowe Tabele 6-8), ale waga narządów w stosunku do masy mózgu była porównywalna do grup kontrolnych. Te statystycznie istotne sporadyczne zmiany u samców otrzymujących dawkę 2000 mg/kg mc./dobę (względne i bezwzględne w stosunku do masy ciała) wynikały prawdopodobnie z nieznacznie zmniejszonej masy ciała na czczo i mieściły się w granicach normalnej biologicznej zmienności, o czym świadczy fakt, że nadal mieściły się w normie dla danego laboratorium. U samic nie zaobserwowano statystycznie istotnych zmian w bezwzględnej masie narządów, z wyjątkiem nieco niższej masy macicy w grupie wysokiej dawki, co prawdopodobnie wynikało z liczby samic w cyklu estrus w grupie kontrolnej (6/10 w porównaniu do 0/10 w grupie wysokiej dawki). Stwierdzono statystycznie istotne zwiększenia masy wątroby w stosunku do masy ciała i masy mózgu w grupach niskiej i wysokiej dawki; jednakże nie były one związane z dawką i nie występowały z nimi związane zmiany mikroskopowe. Żadne z tych drobnych zmian, u samców i samic, nie były uważane za związane z testowanym związkiem ani biologicznie istotne.

Z wyjątkiem pyelectasii u kilku samców, zaobserwowano zmiany mikroskopowe w jelicie ślepym, najądrzach, nerkach, wątrobie, płucach, skórze, śledzionie i grasicy u poszczególnych zwierząt i/lub o podobnej częstości występowania w grupach leczonych i kontrolnych. U samic zaobserwowano zmiany mikroskopowe w grasicy i nerkach u zwierząt leczonych o podobnej lub większej częstości występowania niż u zwierząt kontrolnych, a zmiany w macicy występowały częściej w grupie kontrolnej (patrz Tabela 12). Obserwowane Zmiany mikroskopowe zostały uznane za przypadkowe, typowe dla tego szczepu i wieku szczurów, obecne u pojedynczych zwierząt i/lub występujące z podobną częstością zarówno w grupach leczonych, jak i kontrolnych; dlatego nie uważano ich za związane z testowanym związkiem.

Przedstawione badanie dostarcza kolejnych dowodów na to, że wysoko oczyszczony i dobrze scharakteryzowany Ge-132 ma bardziej korzystny profil toksyczności niż dwutlenek germanu. Jak omówiono we wstępie, w przeciwieństwie do poprzednich prac, które opisywały toksyczność nerkową u modeli zwierzęcych i przypadki kliniczne u ludzi po spożyciu „związków zawierających german”, z których większość zawierała dwutlenek germanu, Ge-132 o czystości ≥99,6% nie wywołał makroskopowych ani mikroskopowych uszkodzeń nerek w niniejszym badaniu trwającym 90 dni. Dodatkowo, obserwowane w tym badaniu pirelektazje nie były towarzyszone przez stan zapalny ani degenerację, a wodonercze było przypadkowe u jednego zwierzęcia kontrolnego. Podobne wyniki dotyczące masy ciała i parametrów biochemicznych zaobserwowano w tym badaniu i w badaniach Anger et al. [13] (tylko samce; zmniejszenie przyrostu masy ciała, białka całkowitego, albuminy), jednak żadne z tych wyników nie wskazywały na patologię nerek ani na istotność toksykologiczną. „Lekka dysfunkcja nerek” zgłoszona przez Anger et al. po podawaniu Ge-132 w dawce 1000 mg/kg mc./dobę (5 dni w tygodniu przez 6 miesięcy) polegała na nieznacznie, ale nieistotnie statystycznie, podwyższonym stężeniu kreatyniny oraz histologicznych zmianach nerek opisanych jako „choroba kanalików” u niektórych samców poddawanych leczeniu („obecność cylindrów, obrzęk komórek kanalików i odkładanie się flokulusów”). Nie jest jasne, co oznaczają obecnie wyniki dotyczące nerek, ponieważ w niniejszym badaniu nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości ani degeneracyjnych zmian nerek, a wskaźniki funkcji nerek nie były niekorzystnie wpływane. W innym badaniu po doustnym podaniu Ge-132 w dawce 120 mg/kg mc./dobę szczurom samicom masy ciała i wyniki hematologiczne były podobne jak u kontrolnych zwierząt, jednak stężenie azotu mocznikowego we krwi było istotnie wyższe w tygodniach 4 i 12, a istotnie niższe w tygodniu 20 w porównaniu z kontrolą [8]. Stężenie kreatyniny w surowicy i wyniki analizy moczu były podobne jak u kontrolnych zwierząt, a nie zaobserwowano istotnych zmian histologicznych nerek. Miyao i współpracownicy zgłosili, że po 6-miesięcznym podawaniu Ge-132 w dawkach 30, 300 i 3000 mg/kg mc. (brak dostępnych danych) nie zaobserwowano „toksycznych efektów ani nieprawidłowości w badaniach laboratoryjnych, klinicznych i patologicznych” [12]. W badaniu dotyczącym działania rakotwórczego Doi i in. nie stwierdzono histopatologicznych zmian nerek w żadnej grupie dawkowej. Jednakże, luźne stolce wystąpiły u wszystkich zwierząt w grupie o dawce 2,5% (podobnie jak w przypadku grupy wysokodawkowej w niniejszym badaniu), a u niektórych zwierząt zaobserwowano rozszerzenie kątnicy. Autorzy spekulowali, że te zmiany związane z dawką mogą wynikać z ciśnienia osmotycznego w kątnicy [14]. We wszystkich tych badaniach, podobnie jak w niniejszym badaniu, Ge-132 nie wykazał żadnego toksycznego działania w badanych dawkach. W opublikowanych opisach przypadków przewlekłego spożycia związków zawierających german (głównie nieorganiczny german) dochodziło do niewydolności nerek. Nie ma dowodów na występowanie tego zjawiska w obecnych badaniach dotyczących Ge-132

4. Wnioski

Podsumowując, przeprowadzone w niniejszej pracy badania dotyczące genetycznej toksyczności dostarczają dowodów na to, że Ge-132 o czystości ≥99,6% nie wykazuje potencjału mutagennego, klastogennego ani in vivo genotoksycznego w zastosowanych systemach testowych, w granicach maksymalnie zalecanych stężeń testowych lub dawki granicznej. Nie zaobserwowano żadnych przypadków śmiertelności ani niepożądanych efektów, a także nie zidentyfikowano organów docelowych u szczurów Han:WIST samców i samic po 90-dniowym podawaniu doustnym Ge-132 w dawkach 500, 1000 lub 2000 mg/kg mc/dzień. Na podstawie obserwacji w tym badaniu 90-dniowym ustalono, że nieobserwowanym dawkowym poziomem bezpieczeństwa (NOAEL) jest 2000 mg/kg mc/dzień. Skróty 2AA: 2-aminoantracen 9AA: 9-aminoakrydyna mc: Masa ciała DME: Modyfikowane przez Dulbecco środowisko Eagle’a DMSO: Dimetylosulfotlenek EMS: Etylometansulfonian EPA: Agencja Ochrony Środowiska FOB: Funkcjonalna bateria obserwacyjna GLP: Dobre praktyki laboratoryjne MPCE: Polichromatyczne erytrocyty z mikronukleusami MMS: Metylometansulfonian NOAEL: Dawka bez obserwowanych niekorzystnych efektów NPD: 4-nitro-1,2-fenylenodianina OECD: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju OPPTS: Biuro ds. Zapobiegania, Pestycydów i Substancji Toksycznych PCE: Polichromatyczne erytrocyty SAZ: Azotek sodu Dostępność danych Średnie zestawy danych generowane i wykorzystywane do analizy statystycznej w celu potwierdzenia wyników tych badań są zawarte w artykule lub w plikach dodatkowych informacji. Wszystkie inne nieprzetworzone i przetworzone dane użyte do potwierdzenia wyników tych badań są dostępne u autora korespondencyjnego na wniosek. Wszystkie dokumenty eksperymentalne, próbki i dane są archiwizowane zgodnie z zasadami dobrych praktyk laboratoryjnych w archiwach TOXICOOP, Zrt. w Balantonfured, na Węgrzech. Konflikty interesów AIBMR Life Sciences, Inc. zostało zatrudnione przez sponsora badań jako niezależna trzecia strona w celu ustalenia odpowiednich protokołów badawczych i wybor dawek, zorganizowania badań, zatwierdzenia planów badawczych oraz monitorowania opisanych w niniejszej pracy badań toksykologicznych, a także analizowania, interpretowania danych i przygotowywania manuskryptu. Toxi-Coop Zrt. zostało zatrudnione przez AIBMR do opracowania planów badawczych, przeprowadzenia, analizy i interpretacji oraz raportowania wyników opisanych w niniejszej pracy badań toksykologicznych. Autorzy nie zgłosili dodatkowych konfliktów interesów dotyczących badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu.

Skróty

Dostępność danych

Średnie zbiory danych wygenerowane i wykorzystane do analizy statystycznej w celu poparcia wyników tych badań są zawarte w artykule lub w plikach z dodatkowymi informacjami. Wszystkie inne surowe i przetworzone dane użyte do poparcia wyników tych badań są dostępne u autora korespondencyjnego na żądanie. Wszystkie protokoły eksperymentalne, próbki i dane są przechowywane zgodnie z GLP w archiwach TOXI-COOP, Zrt. w Balatonfured, na Węgrzech.

Konflikty interesów

AIBMR Life Sciences, Inc. zostało zatrudnione przez sponsora badań jako niezależna strona trzecia do określenia odpowiednich protokołów badawczych i wyboru dawek, przeprowadzenia badań, zatwierdzenia planów badawczych, monitorowania opisanych w niniejszym artykule badań toksykologicznych oraz analizy, interpretacji danych i przygotowania artykułu. Toxi-Coop Zrt. zostało zatrudnione przez AIBMR do opracowania planów badawczych, przeprowadzenia, analizy, interpretacji i raportowania wyników opisanych w niniejszym artykule badań toksykologicznych. Autorzy nie zgłosili żadnych dodatkowych konfliktów interesów dotyczących badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu.

Wkład autorów

Podziękowania

Materiały uzupełniające

References

1. S.-H. Tao and P. M. Bolger, “Hazard assessment of germanium supplements,” Regulatory Toxicology and Pharmacology, vol. 25, no. 3, pp. 211–219, 1997.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

2. B. J. Kaplan, G. M. Andrus, and W. W. Parish, “Germane facts about germanium sesquioxide: II. Scientific error and misrepresentation,” The Journal of Alternative and Complementary Medicine, vol. 10, no. 2, pp. 345–348, 2004.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

3. B. E. Lück, H. Mann, H. Melzer, L. Dunemann, and J. Begerow, “Renal and other organ failure caused by germanium intoxication,” Nephrology Dialysis Transplantation, vol. 14, no. 10, pp. 2464–2468, 1999.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

4. N. Nagata, T. Yoneyama, K. Yanagida et al., “Accumulation of germanium in the tissues of a long-term user of germanium preparation died of acute renal failure,” The Journal of Toxicological Sciences, vol. 10, no. 4, pp. 333–341, 1985.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

5. K. Obara, T. Saito, H. Sato et al., “Germanium poisoning: clinical symptoms and renal damage caused by long-term intake of germanium,” Japanese Journal of Medicine, vol. 30, no. 1, pp. 67–72, 1991.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

6. K. Okada, K. Okagawa, K. Kawakami et al., “Renal failure caused by long-term use of a germanium preparation as an elixir,” Clinical Nephrology, vol. 31, no. 4, pp. 219–224, 1989.

   View at: Google Scholar

7. S. Okuda, S. Kiyama, Y. Oh et al., “Persistent renal dysfunction induced by chronic intake of germanium-containing compounds,” Current Therapeutic Research, vol. 41, no. 2, pp. 265–275, 1987.

   View at: Google Scholar

8. T. Sanai, S. Okuda, K. Onoyama et al., “Chronic tubulointerstitial changes induced by germanium dioxide in comparison with carboxyethylgermanium sesquioxide,” Kidney International, vol. 40, no. 5, pp. 882–890, 1991.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

9. T. Sanai, K. Onoyama, S. Osato et al., “Dose dependency of germanium-dioxide-induced nephrotoxicity in rats,” Nephron, vol. 57, no. 3, pp. 349–354, 1991.

   View at: Publisher Site | Google Scholar

10. T. Sanai, N. Oochi, S. Okuda et al., “Subacute nephrotoxicity of germanium dioxide in the experimental animal,” Toxicology and Applied Pharmacology, vol. 103, no. 2, pp. 345–353, 1990.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

11. T. Sanai, S. Okuda, K. Onoyama et al., “Germanium dioxide-induced nephropathy: a new type of renal disease,” Nephron, vol. 54, no. 1, pp. 53–60, 1990.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

12. K. Miyao, T. Onishi, K. Asai, S. Tonizawa, and F. Suzuki, “Toxicology and phase I studies on a novel organogermanium compound, Ge-132. Current chemotherapy and infectious disease,” in Proceedings of the 11th ICC and the 19th ICAAC American Society for Microbiology (ASM), pp. 1527–1529, Washington, DC, USA, 1980.

    View at: Google Scholar

13. F. Anger, J. P. Anger, L. Guillou, A. Papillon, C. Janson, and Y. Sublet, “Subchronic oral toxicity (six months) of carboxyethylgermanium sesquioxide [(HOOCCH₂CH₂Ge)₂O₃]_n in rats,” Applied Organometallic Chemistry, vol. 6, no. 3, pp. 267–272, 1992.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

14. Y. Doi, N. Imai, M. Suguro, T. Numano, and F. Furukawa, “No carcinogenicity of poly-trans-[(2-carboxyethyl) germasesquioxane](Ge-132): 26-week feeding study using rasH2 mice,” Fundamental Toxicological Sciences, vol. 4, no. 3, pp. 137–150, 2017.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

15. B. J. Kaplan, W. W. Parish, G. M. Andrus, J. S. A. Simpson, and C. J. Field, “Germane facts about germanium sesquioxide: I. Chemistry and anticancer properties,” The Journal of Alternative and Complementary Medicine, vol. 10, no. 2, pp. 337–344, 2004.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

16. OECD, OECD Principles on Good Laboratory Practice, OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring, OECD Publishing, Paris, France, 1998.

17. A. E. Clewell, E. Béres, A. Vértesi et al., “A comprehensive toxicological safety assessment of an extract of Olea europaea L. leaves (bonolive™),” International Journal of Toxicology, vol. 35, no. 2, pp. 208–221, 2016.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

18. T. K. Marx, R. Reddeman, A. E. Clewell et al., “An assessment of the genotoxicity and subchronic toxicity of a supercritical fluid extract of the aerial parts of hemp,” Journal of Toxicology, vol. 2018, Article ID 8143582, 26 pages, 2018.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

19. R. Reddeman, R. Glávits, J. R. Endres et al., “A toxicological evaluation of mango leaf extract (Mangifera indica) containing 60% mangiferin,” Journal of Toxicology, vol. 2019, Article ID 4763015, 14 pages, 2019.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

20. National Center for Biotechnology Information, “PubChem compound database; CID 83030. Propagermanium,” 2019, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/83030.

    View at: Google Scholar

21. P. Krystek and R. Ritsema, “Analytical product study of germanium-containing medicine by different ICP-MS applications,” Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, vol. 18, no. 1, pp. 9–16, 2004.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

22. Q.-C. Chen, S.-F. Mou, Y. Yan, and Z.-M. Ni, “Separation and determination of inorganic germanium and β-carboxyethylgermanium sesquioxide by high-performance ionexclusion chromatography,” Journal of Chromatography A, vol. 789, no. 1-2, pp. 403–412, 1997.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

23. B. N. Ames, J. McCann, and E. Yamasaki, “Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test,” Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 31, no. 6, pp. 347–364, 1975.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

24. D. M. Maron and B. N. Ames, “Revised methods for the Salmonella mutagenicity test,” Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 113, no. 3-4, pp. 173–215, 1983.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

25. L. D. Kier, D. J. Brusick, A. E. Auletta et al., “The Salmonella typhimurium/mammalian microsomal assay. A report of the U.S. environmental protection agency gene-tox program,” Mutation Research, vol. 168, no. 2, pp. 69–240, 1986.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

26. S. Venitt and J. Parry, Mutagenicity Testing, a Practical Approach, IRL Press Limited, Oxford, UK, 1984.

27. OECD, Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, France, 1997.

28. OECD, Test No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD Publishing, Paris, France, 2016.

29. D. Hamden, ISCN 1985: An International System for Human Cytogenic Nomenclature. Report of the Standing Committee on Human Cytogenic Nomenclature, Standing Committee on Human Cytogenic Nomenclature, Basel, Switzerland, 1985.

30. J. R. Savage, “Classification and relationships of induced chromosomal structual changes,” Journal of Medical Genetics, vol. 13, no. 2, pp. 103–122, 1976.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

31. J. Savage, “Some practical notes on chromosomal aberrations,” Clinical Cytogenetics Bull, vol. 1, pp. 64–76, 1983.

    View at: Google Scholar

32. OECD, Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD Publishing, Paris, France, 2016.

33. OECD, Test No. 408: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, France, 1998.

34. S. Irwin, “Comprehensive observational assessment: ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse,” Psychopharmacologia, vol. 13, no. 3, pp. 222–257, 1968.

    View at: Publisher Site | Google Scholar

35. A. Clewell, “A toxicological assessment of bis (2-carboxyethylgermanium sesquioxide) (organic germanium) [abstract #3542],” The Toxicologist; Supplement to Toxicological Sciences, vol. 168, no. 1, 2019.

    View at: Google Scholar